L'invention concerne un procédé pour déterminer de manière quantitative la présence de 25-hydroxycholécalciférol, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : ajout d'une quantité définie d'un étalon interne qui présente une masse différente du 25-hydroxycholécalciférol et une polarité similaire à celle d'un autre composé, par exemple le 26,27-hexadeutéro-25-hydroxycholécalciférol, à une dispersion aqueuse de l'aliment ; extraction de la dispersion aqueuse avec du tert.butyl méthyle éther ; et traitement supplémentaire de l'extrait par CLHet par spectrométrie de masse, ces étapes étant spécifiées dans la description.