Procédé pour la détermination d'antibiotiques à noyau bêta-lactame dans un liquide biologique. Ce procédé comporte les stades suivants: 1) l'incubation du liquide biologique avec la D-alanyl-D-alanine-carboxy-peptidase soluble produite par la souche Actinomadura R 39; 2) l'incubation du produit obtenu à la fin du stade 1) avec une solution de substrat; 3) la détermination de la quantité de D-alanine formée au stade 2); 4) la comparaison de la détermination du stade 3) avec un étalon; l'enzyme mise en oeuvre étant immobilisée sur un support insoluble dans l'eau séparée du liquide biologique (stade 1) et lavée avant d'être incubée au stade 2). L'invention concerne également une trousse d'essais comprenant les réactifs à mettre en oeuvre pour l'exécution du procédé.